樣本收集與保存條件

LPO在生物樣本中極不穩(wěn)定。全血樣本必須使用肝素或EDTA抗凝，避免使用枸櫞酸鈉（會螯合鐵離子干擾測定）。采血后2小時內(nèi)分離血漿，3000g離心10分鐘。血漿中LPO在4℃可穩(wěn)定4小時，-80℃可穩(wěn)定2個月。反復(fù)凍融一次LPO損失約15%。組織樣本離體后立即投入液氮，勻漿時加入0.5mM BHT和5μM EDTA，全程避光操作。

碘量法操作步驟

基于LPO中的過氧鍵氧化I?為I?，I?與淀粉顯藍(lán)色（570nm）。反應(yīng)體系：100μL樣本加入900μL冰乙酸-氯仿（3:1），混勻后加入50μL飽和KI溶液，暗處反應(yīng)5分鐘。加入1mL 1%淀粉溶液顯色，立即測570nm?？瞻讓φ沼镁彌_液代替樣本。同時設(shè)置一個不加KI的樣本管扣除背景。該方法線性范圍0.5-20μmol/L，檢測下限0.3μmol/L。注意：KI溶液需新鮮配制，變黃后棄用。

顯色法操作細(xì)節(jié)

市售試劑盒多采用FOX法（Ferrous Oxidation-Xylenol Orange）。原理：LPO在酸性條件下將Fe2?氧化為Fe3?，F(xiàn)e3?與二甲酚橙形成紫色絡(luò)合物（560nm）。操作順序：樣本加入FOX試劑（含250μM Fe2?、25mM H?SO?、100μM二甲酚橙、4mM BHT），25℃反應(yīng)30分鐘。注意加樣后立即混勻，F(xiàn)e2?在空氣中緩慢氧化，工作液應(yīng)在30分鐘內(nèi)用完。樣本蛋白濃度高于2mg/mL時會沉淀，需先用甲醇-氯仿提取脂質(zhì)后再測定。

微板法高通量操作

96孔板每孔加入50μL樣本、200μL FOX試劑，振蕩10秒后室溫孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀讀取560nm。每板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線（-過-氧-化-氫-異丙苯 0-20μM）和三個質(zhì)控孔（已知LPO濃度的混合血清）。板間差異通過質(zhì)控孔校正。注意：不同品牌的微孔板本底吸收不同，建議使用同一批號的板子。加樣時避免氣泡，氣泡會導(dǎo)致光散射使讀數(shù)偏高。

結(jié)果計算與常見錯誤

LPO濃度（μM）= (A樣本 - A空白) / (A標(biāo)準(zhǔn) - A空白) × 標(biāo)準(zhǔn)品濃度。常見錯誤：未扣除樣本自身的顏色干擾（如溶血樣本的紅色背景），此時需設(shè)置樣本空白（不加FOX試劑中的Fe2?）。另一個錯誤是使用玻璃比色皿，碘量法中I?會吸附在玻璃表面造成殘留污染，應(yīng)使用一次性塑料比色皿或96孔板。檢測血清樣本時，脂血樣本（甘油三酯>3mM）需先離心去除乳糜顆粒，否則濁度干擾嚴(yán)重。