檢測(cè)體系的核心邏輯

超氧陰離子清除能力分析不直接測(cè)量O??濃度，而是測(cè)量待測(cè)樣品抑制O??產(chǎn)生指示信號(hào)的能力。所有試劑盒均采用競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)：系統(tǒng)以恒定速率生成O??，同時(shí)加入指示劑（如WST-1、硝基藍(lán)四唑NBT）與O??反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。樣品中的清除劑（SOD、抗壞血酸等）與指示劑競(jìng)爭(zhēng)消耗O??，信號(hào)降低程度反映清除能力。清除能力用抑制率或Trolox當(dāng)量表達(dá)。

WST-1法的化學(xué)原理

WST-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2H-四唑鹽）是一種四唑鹽。O??還原WST-1生成水溶性甲臜，450nm吸光度上升。還原反應(yīng)特異性強(qiáng)，不會(huì)被O??以外的活性氧（如H?O?、·OH）還原。O??由黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生。反應(yīng)混合物中含0.05U/mL黃嘌呤氧化酶、0.1mM黃嘌呤、0.3mM WST-1，在37℃反應(yīng)20分鐘。樣品清除O??后，甲臜生成量減少。抑制率計(jì)算公式：(ΔA對(duì)照 - ΔA樣品) / ΔA對(duì)照 × 100%。

清除能力的表達(dá)方式

結(jié)果以IC50值（清除50% O??所需的樣品濃度）或Trolox當(dāng)量（μmol Trolox/mg蛋白）表示。Trolox是一種水溶性維生素E類似物，作為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.1-5 mM）。單位定義：1單位清除能力相當(dāng)于1μmol Trolox的清除效果。對(duì)于細(xì)胞裂解液，結(jié)果需除以蛋白濃度，單位為μmol Trolox/mg。對(duì)于純化物質(zhì)（如植物提取物），直接報(bào)告IC50值，數(shù)值越小清除能力越強(qiáng)。

NBT還原法的原理

NBT（硝基藍(lán)四唑）在O??還原下生成不溶性的藍(lán)紫色甲臜，560nm檢測(cè)。NBT法靈敏度低于WST-1，但成本低廉。NBT終濃度0.1mM，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。缺點(diǎn)：甲臜沉淀需用二甲基亞砜（DMSO）溶解后讀數(shù)，增加了操作步驟。且NBT會(huì)被細(xì)胞色素c、谷胱甘肽等還原性物質(zhì)直接還原，產(chǎn)生假陽(yáng)性。WST-1法則基本不受這些干擾，是目前的主流方法。

化學(xué)發(fā)光法的增強(qiáng)原理

使用魯米諾或光澤精作為發(fā)光底物。O??氧化魯米諾產(chǎn)生425nm化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與O??濃度線性相關(guān)。加入樣品后發(fā)光減弱，抑制率反映清除能力。反應(yīng)體系中加入增強(qiáng)劑（如對(duì)碘苯酚）可將發(fā)光信號(hào)放大10倍，檢測(cè)限低至0.01U/mL SOD當(dāng)量?；瘜W(xué)發(fā)光法需要專用檢測(cè)儀，且對(duì)pH和溫度敏感（pH 8.0-8.5，25℃最佳）。適用于高通量藥物篩選，不適用于含有金屬離子（Fe2?、Cu2?）的樣本，金屬離子催化魯米諾自發(fā)光。

對(duì)照反應(yīng)的必要性

所有清除能力測(cè)定必須設(shè)置三個(gè)對(duì)照：試劑空白（不加黃嘌呤氧化酶，用于扣除自發(fā)還原）；背景對(duì)照（不加WST-1，用于扣除樣品自身顏色）；-完-全-反應(yīng)對(duì)照（不加樣品，用于計(jì)算最大信號(hào)）。每個(gè)樣品至少兩個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值后扣除相應(yīng)對(duì)照。忽略對(duì)照會(huì)導(dǎo)致清除能力被嚴(yán)重高估或低估。