檢測波長與顯色原理

AOPP是蛋白質(zhì)在氧化應(yīng)激下形成的含雙酪氨酸的交聯(lián)產(chǎn)物。比色法檢測波長340nm。原理：AOPP在酸性條件下與碘化鉀反應(yīng)，生成的三碘化物離子在340nm有特征吸收。氯胺-T作為標(biāo)準(zhǔn)品，因氯胺-T在340nm的摩爾消光系數(shù)與AOPP相近。反應(yīng)體系：200μL樣本加入1mL 20mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和200μL 1.16M KI，渦旋混勻后立即測340nm。

線性范圍與靈敏度

AOPP檢測的典型線性范圍：20-200 μmol/L氯胺-T當(dāng)量。最較低檢測限為5 μmol/L。健康人血清參考區(qū)間：50-110 μmol/L；慢性腎病患者：150-300 μmol/L；透析患者可高達(dá)400 μmol/L。超出線性范圍的高值樣本需用PBS稀釋后重測，稀釋倍數(shù)不超過10倍（過高稀釋會導(dǎo)致誤差放大）。低值樣本（<20 μmol/L）可通過增加樣本體積至400μL，相應(yīng)減少緩沖液體積來提高檢測靈敏度。

干擾物質(zhì)及其容許濃度

游離酪氨酸濃度高于100μM會干擾，因酪氨酸在340nm有微弱吸收。膽紅素高于50μM時(shí)需設(shè)置樣本空白（不加KI），并在計(jì)算時(shí)扣除。甘油三酯高于2mM導(dǎo)致濁度增加，可通過樣本4℃ 12000g離心15分鐘去除乳糜。血紅蛋白高于0.5g/L時(shí)需用氯仿提取后再測定。最嚴(yán)重的干擾來自樣本中的次氯酸（HOCl），其氧化活性會持續(xù)產(chǎn)生新的AOPP，檢測前加入10mM甲硫氨酸淬滅。

消光系數(shù)與校準(zhǔn)曲線

氯胺-T標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 857319）溶于PBS，濃度0-200μM。氯胺-T在340nm的消光系數(shù)為20,000 M?1·cm?1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自行測定此值，因不同批次氯胺-T的純度差異。校準(zhǔn)曲線需包含至少6個(gè)濃度點(diǎn)，每點(diǎn)重復(fù)3次。曲線通過強(qiáng)制過零點(diǎn)（扣除試劑空白）或非強(qiáng)制零點(diǎn)均可，但非強(qiáng)制零點(diǎn)時(shí)截距不應(yīng)超過10%的標(biāo)準(zhǔn)品較低點(diǎn)響應(yīng)值。曲線相關(guān)系數(shù)要求R2 ≥ 0.99。

試劑穩(wěn)定性參數(shù)

碘化鉀溶液（1.16M）需避光保存，光照下I?被氧化為I?使空白升高。KI溶液在4℃避光可穩(wěn)定2周，出現(xiàn)黃色即棄用。磷酸鹽緩沖液（20mM，pH 7.4）可室溫存放1個(gè)月。氯胺-T標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10mM）需用PBS新鮮配制，4℃避光可使用5天，-20℃分裝可保存1個(gè)月，但凍融會降解。樣本檢測應(yīng)在取樣后4小時(shí)內(nèi)完成，長期保存的樣本（-80℃）測得的AOPP值比新鮮樣本低10-15%。