組織與細(xì)胞樣本的前處理

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）存在胞質(zhì)型（PEPCK-C）和線粒體型（PEPCK-M）。大鼠肝臟以胞質(zhì)型為主，小鼠腎臟兩者均有。樣本采集后立即液氮冷凍，勻漿緩沖液含50mM HEPES（pH 7.4），0.25M蔗糖，1mM DTT，0.1mM EDTA。勻漿后10000g離心15分鐘，上清用于胞質(zhì)型測(cè)定；線粒體型需差速離心富集線粒體（12000g，20分鐘），沉淀用0.1% Triton X-100裂解。所有操作在4℃完成。

反應(yīng)體系與加樣順序

PEPCK催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）+ GDP + HCO?? → 草酰乙酸 + GTP。偶聯(lián)蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）法：草酰乙酸 + NADH → 蘋(píng)果酸 + NAD?，檢測(cè)340nm吸光度下降。反應(yīng)混合液（1mL）：50mM HEPES（pH 7.0），5mM MgCl?，50mM KCl，1mM DTT，0.2mM NADH，1mM PEP，0.2mM GDP，20mM NaHCO?，2U MDH。預(yù)熱至30℃后加入10-50μL樣本啟動(dòng)反應(yīng)?？瞻讓?duì)照不加PEP或GDP。注意NaHCO?需新鮮配制，CO?逸出會(huì)導(dǎo)致活性低估。

酶量線性范圍與動(dòng)力學(xué)曲線

控制ΔA340/min在0.02-0.10之間。PEPCK活性較低（肝臟約10-50 mU/mg蛋白），通常不稀釋直接測(cè)定。若ΔA<0.01，增加樣本體積或濃縮樣本。監(jiān)測(cè)時(shí)間5-10分鐘，取線性較好的3分鐘區(qū)間。曲線出現(xiàn)彎曲（速率下降）可能因NADH耗盡或產(chǎn)物GTP抑制，需減少樣本量。使用石英比色皿，光徑1cm。微孔板檢測(cè)時(shí)每孔總反應(yīng)體積200μL，光徑校正約0.5cm，靈敏度下降一半。

放射性法的替代操作

當(dāng)樣本含有干擾NADH氧化的物質(zhì)（如高濃度谷胱甘肽），改用放射性同位素法。反應(yīng)含[1?C]碳酸氫鹽，產(chǎn)物為[1?C]草酰乙酸，經(jīng)TLC或酸不穩(wěn)定法分離。操作：反應(yīng)30分鐘后加入-三-氯-乙-酸-終止，通氮?dú)獯等ノ捶磻?yīng)的1?CO?，剩余液閃計(jì)數(shù)。該方法靈敏度高（檢測(cè)下限0.1 mU），但需放射性防護(hù)。草酰乙酸自發(fā)脫羧為丙酮酸，須在終止后1小時(shí)內(nèi)完成測(cè)定。

常見(jiàn)干擾與校正方法

內(nèi)源性草酰乙酸：肝臟樣本含少量草酰乙酸，消耗NADH產(chǎn)生背景。設(shè)置不加PEP的對(duì)照管，從總速率中扣除。GDP酶活性：樣本中GDP酶水解GDP，降低底物濃度。加入磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶（PK）再生GDP，但PK會(huì)消耗PEP。碳酸酐酶：樣本中碳酸酐酶加速CO?水合，不影響測(cè)定但可能改變pH。使用HEPES緩沖液維持pH穩(wěn)定。金屬離子：添加1mM MnCl?可提高PEPCK活性，但Mn2?干擾MDH，一般不使用。

結(jié)果計(jì)算與單位換算

活性（U/mg蛋白）= (ΔA/min × 總體積ml) / (6.22 × 光徑cm × 樣本體積ml × 蛋白mg)。注意溫度校正：30℃下測(cè)得的活性乘以1.2約等于37℃活性。標(biāo)準(zhǔn)品可使用純化的大鼠PEPCK（Sigma，活性約5 U/mg），但價(jià)格昂貴。推薦每批實(shí)驗(yàn)運(yùn)行質(zhì)控樣本（大鼠肝臟勻漿），批間CV<10%。蛋白濃度用BCA法（不含DTT干擾），Bradford法受DTT影響。