乳酸脫氫酶催化的核心反應(yīng)

乳酸脫氫酶（LDH）催化丙酮酸與乳酸的可逆轉(zhuǎn)化，同時伴隨NADH與NAD?的互變。檢測LDH活性通常采用“正向反應(yīng)"：乳酸 + NAD? → 丙酮酸 + NADH，或“逆向反應(yīng)"：丙酮酸 + NADH → 乳酸 + NAD?。逆向反應(yīng)速率約為正向的3-5倍，因此多數(shù)試劑盒選用丙酮酸-NADH體系，檢測340nm處NADH吸光度的下降速率。每消耗1分子NADH，340nm吸光度下降約6.22 mM?1·cm?1。

偶聯(lián)酶法的信號放大機(jī)制

當(dāng)樣本LDH活性過低（<0.01 U/mL）時，直接測定NADH變化信噪比不足。采用偶聯(lián)法：LDH生成的丙酮酸在丙酮酸氧化酶催化下產(chǎn)生H?O?，再與4-氨基安替比林和色原（如TOOS）在過氧化物酶作用下生成醌亞胺染料（550nm）。信號放大倍數(shù)可達(dá)10-20倍。偶聯(lián)法檢測下限0.001 U/mL，適合細(xì)胞培養(yǎng)上清中微量LDH釋放的測定（細(xì)胞毒性實驗）。需注意丙酮酸氧化酶對底物丙酮酸的特異性，避免內(nèi)源性丙酮酸干擾。

乳酸脫氫酶同工酶的區(qū)分原理

哺乳動物L(fēng)DH由M亞基和H亞基組成五種四聚體同工酶（LDH1-LDH5）。不同同工酶對底物親和力和熱穩(wěn)定性存在差異。采用α-酮丁酸代替丙酮酸，LDH1和LDH2對其反應(yīng)速率較高；**加熱樣本（60℃，30分鐘）**后LDH5-LDH3失活，LDH1-LDH2保留活性。通過差減法計算各同工酶比例。臨床診斷中LDH1/LDH2比值對心肌損傷有提示意義。試劑盒若需區(qū)分同工酶，必須提供不同底物溶液和熱處理方案。

乳酸脫氫酶釋放法（細(xì)胞毒性）的原理

細(xì)胞膜損傷時LDH釋放到培養(yǎng)上清。上清LDH活性與死細(xì)胞數(shù)量成比例。檢測時分別測定“最大釋放組"（裂解液處理）、“實驗組"和“自發(fā)釋放組"（未處理細(xì)胞）。細(xì)胞毒性(%)= (實驗組-自發(fā)組)/(最大組-自發(fā)組)×100%。該原理假設(shè)LDH在細(xì)胞內(nèi)外催化效率一致，但血清中LDH抑制物（如抗體）會導(dǎo)致低估，此時需采用標(biāo)準(zhǔn)品曲線校正。反應(yīng)體系中加入0.1% BSA可減少非特異性吸附。

雙波長校正原理

當(dāng)樣本有濁度或背景色（如含酚紅細(xì)胞培養(yǎng)液），單波長340nm讀數(shù)誤差大。采用340nm和380nm雙波長，計算ΔA340 - ΔA380。380nm處NADH和NAD?均無吸收，但濁度散射光強(qiáng)與波長成反比，差值法扣除背景。另一方案：在反應(yīng)結(jié)束后加入NaOH使NADH轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物（激發(fā)340nm，發(fā)射460nm），熒光法靈敏度更高且不受背景色干擾，但需要熒光酶標(biāo)儀。