檢測(cè)波長與顯色體系

ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）被過硫酸鉀氧化生成藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS?·，特征吸收峰在734nm、645nm和414nm。常用734nm，該波長下常見樣品（如黃酮類、酚酸類）的自身吸收最小。ABTS?·溶液的初始吸光度需精確控制在0.700 ± 0.020（734nm，1cm光徑）。吸光度高于0.720時(shí)稀釋，低于0.680時(shí)重新制備。稀釋使用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，5mM）。

反應(yīng)時(shí)間與溫度系數(shù)

ABTS?·與抗氧化劑的反應(yīng)在30秒內(nèi)完成大部分，但平衡需2-6分鐘。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時(shí)間為6分鐘，室溫（22-25℃）下進(jìn)行。溫度每升高1℃，反應(yīng)速率增加約8%，但ABTS?·自身穩(wěn)定性下降。反應(yīng)超過10分鐘后，ABTS?·自發(fā)衰減速率達(dá)到每分鐘0.5%。建議使用恒溫酶標(biāo)儀或恒溫水浴。動(dòng)力學(xué)模式下，讀取2分鐘至6分鐘之間的線性區(qū)平均速率，比終點(diǎn)法更準(zhǔn)確。

線性范圍與Trolox當(dāng)量

以Trolox（6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）為標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍0.1-1.0mM。ABTS清除能力表達(dá)為μmol Trolox當(dāng)量/ mg樣品或μmol Trolox當(dāng)量/ L。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2需達(dá)到0.998以上。檢測(cè)下限為0.02mM Trolox當(dāng)量。對(duì)于高活性樣品，稀釋后測(cè)定使其清除率落在20%-80%區(qū)間。注意：Trolox標(biāo)準(zhǔn)品需用甲醇配制成10mM儲(chǔ)備液，-20℃保存不超過3個(gè)月，工作液當(dāng)天稀釋。

ABTS?·工作液的穩(wěn)定性參數(shù)

過硫酸鉀氧化法制備ABTS?·：7mM ABTS與2.45mM過硫酸鉀混合，室溫避光放置12-16小時(shí)。制備后的ABTS?·溶液在4℃避光可穩(wěn)定2-3天。稀釋至工作液后（734nm吸光度0.700），室溫下可使用4小時(shí)，4℃可使用8小時(shí)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：工作液在734nm的吸光度變化每小時(shí)不超過0.01。出現(xiàn)沉淀或顏色由藍(lán)綠變?yōu)辄S綠色時(shí)棄用。每次制備后記錄初始吸光度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)批次間通過吸光度校正。

微孔板格式的板間差異控制

96孔板每孔加200μL ABTS?·工作液和20μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。板間差異主要源于溫度不均。酶標(biāo)儀讀數(shù)前，板在室溫平衡10分鐘。邊緣孔效應(yīng)：最外圈孔的溫度比內(nèi)圈低約0.5℃，導(dǎo)致清除率偏低3-5%。只使用中間60孔進(jìn)行檢測(cè)，邊緣孔加入200μL PBS作為熱緩沖。每板設(shè)置6個(gè)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)和3個(gè)質(zhì)控孔（0.5mM Trolox）。不同板之間的質(zhì)控孔讀數(shù)差異超過5%時(shí)，重新校準(zhǔn)儀器或檢查試劑批次。